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Original Article
Prevalence of Possible von Willebrand Disease
Clin Pediatr Hematol Oncol 2014;21:16-22.
Published online April 30, 2014
© 2014 Korean Society of Pediatric Hematology-Oncology and Korean Society for Pediatric Neuro-Oncology

Myoung Sook Lee, M.D.1, Dong Bin Kim, M.D.1, Soon Ki Kim, M.D.2, Ki Young Yoo, M.D.3, Hee Jin Kim, M.D.4, Sun Ho Lee, M.D.5 and Sang Kyu Park, M.D.1

1Department of Pediatrics, Ulsan University Hospital, Ulsan, 2Department of Pediatrics, Inha University Hospital, Incheon, 3Korea Hemophilia Foundation, 4Department of Laboratory Medicine, Samsung Medical Center, Seoul, 5Department of Laboratory Medicine, Ulsan University Hospital, Ulsan, Korea
Correspondence to:
Sang Kyu Park
Department of Pediatrics, Ulsan University Hospital, Bangeojin Soonwhandoro 877, Dong-gu, Ulsan 682-714, Korea
Tel: +82-52-250-7060 Fax: +82-52-250-8071 E-mail: sang@uuh.ulsan.kr
Received March 14, 2014; Revised April 1, 2014; Accepted April 8, 2014.
Abstract
Background: Definition of possible von Willebrand disease (VWD) included levels of von Willebrand factor antigen (VWF:Ag) or von Willebrand factor ristocetin cofactor ac-tivity (VWF:RCo) below 30 U/dL. The purpose of this study was to determine the preva-lence of possible VWD in Ulsan, Korea. We also analyzed the influence of demographic factors such as age, gender, and blood group on subject levels of VWF.Methods: Between March 2011 and September 2011 we prospectively investigated 1,039 subjects (271 children, 768 adults). Blood samples were collected for the determination of VWF:Ag, VWF:RCo, and factor VIII coagulation assay (FVIII:C). A standardized ques-tionnaire was administered to evaluate hemorrhagic symptoms at the time of first exami-nation, using a bleeding score ranging from 0 to 3.Results: Forty five subjects met the criteria for possible VWD, for a prevalence of 4.3%. Subjects of Group O had a significantly lower mean FVIII:C, VWF:Ag, and VWF:RCo value than subjects of group A,B, or AB (P<0.001).Conclusion: Our results suggest that the prevalence of VWD may be much higher than previously reported. Efforts to increase the awareness and diagnosis of VWD may help improve identification of patients with bleeding disorders and lead to early, appropriate management with safe and efficacious therapies.
Keywords: von Willebrand disease, Prevalence, Ulsan
서 론
  폰빌레브란트병(von Willebrand Disease, VWD)은 1926년 Erik von Willebrand에 의해 처음 보고된 유전 출혈질환으로 혈우병A와 함께 가장 흔한 유전 출혈질환으로 알려져 있다[1]. 외국에서는 출혈질환센터에 등록된 환자 수를 근거로 계산한 폰빌레브란트병의 유병률은 0.004-0.01%에 불과 했으며, 일반 인구를 대상으로 출혈증상, 낮은 폰빌레브란트인자(von Willebrand factor, VWF), 가족력이 있는 사람을 선별 검사한 유병률은 발표자에 따라 0.6%에서 1.3%로 다양하게 보고되었다[2-6]. 현재까지 국내에서는 폰빌레브란트병 유병률에 대한 연구가 발표된 가 없으며, 2012년 한국혈우재단 혈우병백서에 따르면 혈우병A 환자는 1,579명이 등록되어 있으나, 폰빌레브란트병 환자는 겨우 98명이 등록되어 있는 실정이다[7]. 저자들은 우리나라의 폰빌레브란트병 유병률 조사의 기초 자료를 얻기 위하여 1,086명의 소아 및 성인을 대상으로 폰빌레브란트병 진단의 검사 기준인 폰빌레브란트인자항원(von Willebrand factor antigen, VWF:Ag) 및 리스토세틴보조인자 활성도(von Willebrand factor ristocetin cofactor acticity, VWF:RCo)가 30 U/dL 미만의 가능성 있는 폰빌레브란트병(possible von Willebrand disease)의 유병률과 VWF:Ag, VWF:RCo가 혈액형, 연령, 성별에 따라서 다른지를 알아보고자 하였다. 또한 설문조사를 실시하여 출혈력을 조사하였다.
대상 및 방법
1) 대상
  2011년 3월부터 2011년 8월까지 검사를 한 1,086명 중에서 혈액형을 모르거나, 설문조사가 미흡한 47명을 제외하였다. 19세 이하의 소아는 울산대학교병원에서 수술 전 검사를 하는 환자와 소아청소년과 외래방문 환자 및 입원 환자 중에서 감염 및 염증 질환이 없는 환자 271명을 대상으로 하였으며, 성인은 자발적으로 검사를 원하는 768명으로 총 1,039명을 대상으로 전향적으로 조사를 하였다. 경구 피임약 복용 중, 임신 중인 여성과 검사 3시간 이내에 격한 운동을 한 대상은 제외하였다.

2) 출혈점수를 위한 설문조사
  설문조사는 2005년 Rodeghiero 등이 개발한 출혈력과 출혈점수를 위한 설문조사를 이용하였다[8]. 코피, 피부증상, 경미한 상처에 의한 출혈, 구강 출혈, 위장관 출혈, 근육 혹은 관절 출혈, 발치 후 출혈, 수술 후 출혈, 월경과다 및 산후 출혈에 대하여 각각 0에서 3까지 등급을 매긴 후 합산하여 출혈점수를 산정하였다(Table 1). 세 가지 이상의 출혈 증세가 있거나 출혈 점수가 남자는 4점, 여자는 6점 이상일 때 의미 있는 출혈력이 있다고 판정하였다.

3) VIII인자 활성도(factor VIII coagulation assay, FVIII:C), VWF 의 측정
  연구대상자의 말초혈액 6 cc를 안정된 상태에서 채취하였고, 3.2% sodium citrate가 함유된 시험관을 사용하였다. 채취된 검체는 3,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 혈장을 분리한 후 -80oC에 보관하였다. VWF:Ag과 VWF:RCo의 측정은 HemosILTM VWF:Ag, VWF:RCo (Instrumentation Laboratory Co., Bedford, MA, USA)를 사용하여 automated latex enhanced immunoassay 방법으로 측정하였다. FVIII:C의 측정은 HemosILTM FVIII deficient plasma (Instrumentation Laboratory Co., Bedford, MA, USA)를 사용하여 human plasma immunodepleted of factor VIII 방법으로 측정하였다.

4) 직접염기서열분석법에 의한 VWF 유전자의 돌연변이 검출
  VWF:Ag 및 VWF:RCo가 모두 30 U/dL 미만인 대상 중에서 유전자검사에 동의한 8명의 말초혈액의 백혈구에서 Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 제작사의 프로토콜에 따라 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA 검체로 VWF 유전자의 모든 엑손(exons)과 그 인접부위염기서열을 증폭할 수 있도록 저자들이 직접 제작한 시동체(primer)를 사용하여 thermal cycler (Model 9700; Applied Biosystems, Foster City, California, USA)에서 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 시행하였다. PCR 산물(amplicon)로 동일한 시동체를 이용하여 BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit(Applied Biosystems, Rotkreuz, Switzerland)를 이용하여 염기서열분석기(ABI Prism 3130 Genetic Analyzer, Applied Biosystems)에서 직접염기서열분석실험을 시행하였다. 얻은 연구대상자의 염기서열파일을 VWF 유전자의 표준염기서열(NT_009759.16, NM_000552.3)과 함께 소프트웨어(Sequencher 4.10.1, Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI, USA)로 분석하여 유의한 변이(variation)를 검출하고, 검출된 변이를 HGVS (Human Genome Variation Society)의 권고(http://www.hgvs.org/mutnomen/)에 따라 기술하였다.

5) 가능성 있는 폰빌레브란트병(possible VWD)
  VWF:Ag 혹은 VWF:RCo의 농도가 30 U/dL 미만이면 가능성 있는 폰빌레브란트병(possible VWD)으로 정의하였다[9].

6) 통계적 방법
  성별, 소아, 성인, 혈액형에 따른 FVIII:C, VWF:Ag, VWF:RCo 평균값의 차이는 t-test로 검증했으며, FVIII:C, VWF:Ag, VWF:RCo의 상관 관계는 Pearson correlation coefficient를 사용하였다. 나이가 VWF:Ag, VWF:RCo에 미치는 영향은 simple regression 분석을 시행하였다. 통계적 유의성은 P값이 0.05 미만인 경우로 하였다. 모든 통계분석은 SPSS(version 21, Chicago, IL, USA)와 R package (version 3.0.2, R foundation for statistical computing, Vienna, Austria)로 시행하였다.
결 과
1) 연령 및 성별
  19세 이하의 소아는 271명, 성인은 768명이었으며 남자가 342명, 여자가 697명이었다(Table 2).

2) 혈액형에 따른 FVIII:C, VWF:Ag, VWF:RCo 농도
  혈액형의 분포는 A형 360명(34.6%), B형 285명(27.4%), AB형 122명(11.7%), O형 272명(26.2%)으로 일반적인 한국인의 혈액형 분포와 일치하였다(Table 3). O형의 FVIII:C, VWF:Ag, VWF:RCo 농도는 A형, B형, AB형에서의 수치 보다 모두 의미 있게 낮았다(Table 4).

3) 연령 및 성별에 따른 FVIII:C, VWF:Ag, VWF:RCo 농도
  남자가 여자보다 FVIII:C, VWF:Ag, VWF:RCo의 농도가 모두 의미 있게 높았으며 소아가 성인보다 FVIII:C, VWF:Ag, VWF:RCo의 농도가 모두 의미 있게 높았다(Table 5). 19세 이하에서는 나이와 VWF:Ag, VWF:RCo 농도가 역상관 관계를 보였으나 20세 이상에서는 나이와 VWF:Ag, VWF:RCo 농도가 높은 상관 관계를 보였다(Fig. 1-4).

4) 가능성 있는 폰빌레브란트병(possible VWD)
  VWF:Ag 및 VWF:RCo가 30 U/dL 미만은 45명(4.3%)이며 남자는 5명(1.5%), 여자는 40명(5.7%)이었다. 소아는 5명(1.8%), 성인은 40명(5.2%)이었다. 혈액형 A형은 13명(3.6%), B형은 5명(1.8%), AB형은 1명(0.8%), O형은 26명(9.6%)이었다. 45명 중 15명(33.3%)이 VWF:RCo/VWF:Ag의 비가 0.7 미만이었다(Table 6).

5) 출혈 점수
  30명(2.9%)에서 의미 있는 출혈력이 있었으며 남자는 4명(1.2%), 여자는 26명(3.7%)이었다. 소아는 7명(2.8%), 성인은 23명(2.9%)이었다 45명의 가능성 있는 폰빌레브란트병에서는 출혈력이 있는 사람이 한 명도 없었다(Table 7). 출혈 증상이 3개 이상은 2.8%로 Rodeghiero의 연구의 정상군의 0.5%와는 차이가 없었으나 필연보인자(obligatory carrier)의 50%에 비하여 의미가 있게 적었다.

6) 유전자 검사결과
  VWF 유전자 검사를 한 8명 중 2명은 기존에 발표된 돌연변이가 있었으며 2명에서는 새로운 돌연변이가 발견되었다. 4명에서는 돌연변이가 발견되지 않았다(Table 8).
고 찰
  국내에서는 혈우재단에 1,579명이 등록되어 있는 혈우병A 환자에 비하여 폰빌레브란트병 환자는 98명만이 등록되어 있는 실정이다. 2011년 세계혈우병연맹의 조사에 의하면 2,628명의 혈우병A 환자가 보고된 Australia의 경우 1,966명의 VWD 환자가 보고되어 있는 것과는 큰 차이를 보인다[10]. 미국의 경우 2010년에 혈우병A가 13,000여명이고, VWD 역시 13,000여명으로 보고하였다[11]. 일본의 경우 혈우병 5,446명에 비하여 984명이 등록되어 있는 것과 비교하여도 현저히 적은 숫자이다[10]. 이는 우리나라에서 VWD 환자가 제대로 진단되지 않고 있거나 혹은 전국적인 통계가 이루어지지 않고 있음을 의미한다. 특히 질환의 특성상, 보통 때는 임상적 증상을 별로 보이지 않기 때문에 혈우재단에 등록하는 환자가 적을 것으로 사료된다. 폰빌레브란트병에 대한 진단기준은 다양하게 많으나 2000년 캐나다 토론토의 소아아동병원(the Hospital for Sick Children, HSC)에서 개발한 진단기준과 2006년에 발표된 세계혈전지혈학회(the International Society on Thrombosis and Haemostasis, ISTH)의 진단기준이 널리 사용되고 있다[9,12]. HSC 진단기준은 VWF:Ag 및 VWF:RCo가 기준치보다 낮으면서 의미가 있는 점막피부출혈 및 폰빌레브란트병의 가족력이 있는 경우, ISTH 진단기준은 낮은 농도의 VWF:Ag 및 VWF:RCo, 의미가 있는 점막피부출혈과 폰빌레브란트병의 가족력 및 VWF 유전자의 돌연변이가 있으면 확정 폰빌레브란트병(definite VWD)으로 정의하였다. 그러나 대부분의 환자에서 이상의 기준을 충족하는 경우가 드물어서 HSC 진단기준은 VWF:Ag 및 VWF:RCo가 기준치보다 낮은 경우, ISTH 진단기준은 낮은 농도의 VWF:Ag 및 VWF:RCo와 의미가 있는 점막피부출혈 및 폰빌레브란트의 가족력이 있으면 가능성 있는 폰빌레브란트병(possible VWD)으로 정의하였다. 본 연구를 시행한 울산 지역에는 등록된 폰빌레브란트병 환자가 한 명뿐이어서 본 연구에 참여한 대상자 중 가족력이 있는 대상자가 한 명도 없으므로 HSC 기준의 가능성 있는 폰빌레브란트병 유병률을 조사하였다. 낮은 농도의 VWF:Ag과 VWF:RCo 기준치도 다양하나 본 연구에서는 2007년 미국 국립보건원 심장 폐 혈액연구원(National Heart, Lung, and Blood Institute)에서 발표한 지침서에 따라서 VWF:Ag 및 VWF:RCo 농도가 30 U/mL 미만을 낮은 농도의 VWF:Ag 및 VWF:RCo로 정의하였다[13].
  ABH 항원의 당화의 차이로 인하여 ABO혈액형이 혈장 VWF의 주 중재자로 알려져 있는데[14], 본 연구에서도 O형의 FVIII:C, VWF:Ag, VWF:RCo 농도가 A형, B형, AB형의 수치보다 모두 의미 있게 낮았다(Table 4). 남자가 여자보다 FVIII:C, VWF:Ag, VWF:RCo의 농도가 모두 의미 있게 높아서 Werner 등의 결과와 일치하는데, 이는 호르몬의 영향과 스트레스 때문이라고 알려져 있다[5,15,16]. 소아가 성인보다 FVIII:C, VWF:Ag, VWF:RCo의 농도가 모두 의미 있게 높았으며(Table 5), 19세 이하에서는 나이와 VWF:Ag, VWF:RCo 농도가 역상관 관계를 보였다(Fig. 13). 이는 나이가 어릴 수록 혈액 채취를 할 때 스트레스로 인하여 VWF의 농도가 증가하기 때문이다[17]. 따라서 소아에서 폰빌레브란트병의 진단시에는 VWF의 농도가 정상이거나 경계에 있더라도 판정에 신중해야 한다. 또한 20세 이상에서는 나이와 VWF:Ag, VWF:RCo 농도가 높은 상관 관계를 보여(Fig. 24) Biron 등의 결과와 일치하였으며 VWF의 농도를 판단할 때 나이도 고려하여야 함을 암시한다[6]. VWF:Ag 및 VWF:RCo가 30 U/dL 미만인 가능성 있는 폰빌레브란트병은 45명(4.3%)이며 이 중 남자는 5명(1.5%), 여자는 40명(5.7%), 소아는 5명(1.8%), 성인은 40명(5.2%)이었다. 혈액형 A형은 13명(3.6%), B형은 5명(1.8%), AB형은 1명(0.8%), O형은 26명(9.6%) 으로 성인 여자, O형에서 유병률이 높았다(Table 6). VWF:RCo/VWF:Ag의 비가 0.7 미만이면 전체 폰빌레브란트 환자의 20-30%를 차지하는 제2형 폰빌레브란트병의 가능성이 높은데, 45명 중 15명(33.3%)이 VWF:RCo/VWF:Ag의 비가 0.7 미만이었다.
  Rodeghiero 등은 출혈력 조사가 폰빌레브란트병의 진단에 민감도 69.1%, 특이성 98.6%를 보여 폰빌레브란트병 진단을 위하여 혈액검사를 해야 되는 대상을 선별하는 데에 유용하다고 하였으나 본 연구에서는 출혈력이 있는 30명 중에(Table 7) 한 명도 가능성 있는 폰빌레브란트병이 없어 폰빌레브란트병 선별검사로서 출혈력 조사의 유용성에 의문이 든다[8]. 따라서 앞으로 우리나라에서 폰빌레브란트병으로 확진된 환자들을 대상으로 출혈력 조사를 하여 출혈력 조사의 유용성을 평가해야 한다고 사료된다. 폰빌레브란트병 필연보인자 42명 중 15명이 의미가 있는 출혈 증상이 없었는데 이 중 6명이 진단 후 수혈을 받는 등의 의미 있는 출혈이 있었다는 보고가 있으므로 본 연구에서의 가능성 있는 폰빌레브란트병 45명은 수술, 출산 시에 세밀한 관찰이 필요하다[8].
  제 1형 폰빌레브란트병의 약 65%에서 유전자 돌연변이가 있으며 이 중 60%는 과오돌연변이에 의한 것이다[18]. 또한 제1형 폰빌레브란트병 가족의 유전자 연관 분석 결과 70%에서 표현형과 유전자 사이에 연관성이 있었다[19]. 따라서 폰빌레브란트병 진단에 유전자 검사를 함으로써 정확도를 높일 수 있다. 본 연구에서는 VWF:Ag, VWF:RCo가 모두 30 U/dL 미만인 23명 중에서 8명에서 유전자검사를 한 결과 2명은 기존에 발표된 돌연변이가 있었으며 2명에서는 새로운 돌연변이가 발견되었다.
  우리나라의 폰빌레브란트병 유병률 조사의 기초자료를 얻기 위하여 1,086명의 소아 및 성인을 대상으로 출혈력 조사와 VWF:Ag 및 VWF:RCo가 30 U/dL 미만의 가능성 있는 폰빌레브란트병의 유병률을 조사한 결과 가능성 있는 폰빌레브란트병의 유병률은 4.3%이었다. 현재 등록된 98명의 폰빌레브란트병 환자보다는 훨씬 많은 환자들이 진단을 받지 못하여 큰 수술이나 출산 시에 발생할 수 있는 대량 출혈의 위험에 노출되어 있다고 생각된다. 따라서 이 연구를 토대로 전국적인 폰빌레브란트병의 유병률에 대한 연구가 필요하며 폰빌레브란트병에 대한 관심과 진단을 높여서 안전하고 효과적인 치료를 하여야 한다.
감사의 글
  This study was supported by a 2011 grant from the Korea Hemophilia Foundation, Seoul, Korea; and from Baxter Pharmaceutical Co., Ltd, 2011.
Figures
Fig. 1. Inverse correlation between age (≤19 y) and VWF:Ag.
Fig. 2. Correlation between age (≥20 y) and VWF:Ag.
Fig. 3. Inverse correlation between age (≤19 y) and VWF:RCo.
Fig. 4. Correlation between age (≥20 y) and VWF:RCo.
Tables
Table. 1. Bleeding score used in the study
Table. 2. Main characteristics of the population studied
Table. 3. Distribution of blood group in 1,039 subjects
Table. 4. Mean values of FVIII:C, VWF:Ag, and VWF:RCo according to the blood group
Table. 5. Mean values of FVIII:C, VWF:Ag, and VWF:RCo according to the gender and the age
Table. 6. Characteristics of 45 possible VWD
Table. 7. Characteristics of 30 who have significant bleeding score (more than two symptoms or score > 3 or 5 in males and females)
Table. 8. Data of the patients for whom candidate implicated mutations of VWF gene were found
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